[실험기본] DNA 분리방법

Bioinformatics를 주로 하다보면 실험적인 개념이 모자랄 때가 있다.

 

이번에 소개할 내용은  DNA 분리시에 알아둬야할 개념들을 정리하였다.

 

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조직, 모근 구강 상피세포, 배양된 세포 및 혈액 등으로 부터 Genomic DNA분리 가능함.

많은 양의 유전체 시료가 필요할 때는 사람의 경우 B세포를 Epstein -Barr virus (EBV)로 감염시켜서 불멸화(Immortalized) 를 유도한다. 그리고 Lymphoblastoid cell line (LCLs)를 만들어서 사용하고 있다.  그러나 이러한 방법은 불멸화유도과정 혹은 배양과정에서 새로운변이가 생길 수 있는 문제점이 있다.

 * EBV의 경우 lymphoma, carcinoma와도 연관이 있음. 헤르페스 바이러스라고 생각하면됨.(1)

 

 최근의 경우 Whole genome amplification 의 발전으로 적은양의 유전체 시료를 이용하더라도 유전체 분석이 가능함.

 

DNA를 추출하는 피는 굳으면 추출해내기 힘들기 때문에 항응고제처리를 하는데, 주로 EDTA를 이용한다. 다른 항응고제의 경우 DNA분석 중에 문제가 발생할 수가 있다.

 ex) heparin의 경우 DNA와 결합이 가능하기때문에 추후 분석에 방해가 됨(2)

 

DNA의 경우 피에서 백혈구세포를 이용하기 때문에 적형구 세포를 제거시키고, 기타 단백질들을 제거시킨다. ( lysis buffer 이용)

 

추출된 DNA의 경우 -70도씨에서 보관하면 된다.

 

DNA 정량 혹은  정도관리의 경우

 생물컴돌이(Bioinformatics)중에서 NGS를 보내기전에 DNA가 추출이 잘 되었는가 확인하는 자료를 본적이 있을것이다.  주로 나는 엑셀에서 A260/A280의 값들을 이용하여서 DNA 오염도를 확인하는 자료들을 본적이 있다.

 

A260/A280이란?

DNA 순도을 확인하기 위하여 분광광도계 형광계 라는 이름의 기계인 nanodrop이나 UV spectrometer라는 기기를 이용한다. 이는 시료에 파장을 쏴서 빚의 흡수도를 이용하여 DNA순도을 확인하는 것이다.

1 A260의 경우 50㎍/ml을 갖고 있으므로, 측정시에 A260이  0.1~1사이의 값을 갖도록 측정이 되어야하고,

 

각 파장마다 측정되는 것은 다음과 같고

A230nm : Phenol, EDTA

A260nm : 핵산 (DNA, RNA)

A280nm : 아미노산들

 

A260/A280만을 이용하여 DNA순도를 확인하는데, 1.8~2.0사이의 값에 들어오면 DNA순도가 적당하다 판단한다.

값이 낮을 경우 아미노산들이 더 섞여있다는 것을 알 수가 있고 (분모가 높을수록 값은 낮아지고, 분모는 아미노산농도값이라 생각하면된다),

높을 경우 DNA보다는 RNA가 섞여서 많이 있을 가능성이 있다.

 

실험하는 친구에게 물어보니

nanodrop의 경우 정도 측정하기에는 정확성이 떨어진다고 합니다.

정확한 정도를 확인하려면 큐빗이라는것과 QPCR를 통해서 확인이 가능하다고 하네요!

그리고 DNA분석시에는 Purity 확인이 크게 중요하지 않다고 하네요

어차피 PCR로 증폭시키면되는 것이기 때문이죠. (그래도 여기 실험실에서는 Nanodrop으로 확인 후 실험합니다.)

 

 

#Reference

1. Kutok, J. L., and F. Wang. "Spectrum of Epstein-Barr virus–associated diseases." Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 1 (2006): 375-404.

2. en.wikipedia.org/wiki/Heparin

Heparin - Wikipedia