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기본적인 개념/실험개념

[실험기본] primer 디자인 (제작)

by 인포메틱스 2020. 6. 29.
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오늘은 primer제작에 대해서 이야기 하려고 합니다.

 

primer 디자인하는 것은 BI로서는 조금 생소 할수도 있을 것 같습니다. (BI 대부분 컴돌이라서.. ?)

 

그래도 만약 소규모 렙이나 회사에 간다면 이런것 즈음 간단하게 알아 주면 괜찮겠죠?

 


프라이머 제작을 하는 이유는 여러가지가 있겠지만, 저는 Sanger sequencing(생어 시퀀싱)을 하기 위한 프라이머 제작을 몇번 해보았습니다. (프라이머 제작은 아마 다 비슷하지 않을까요?)

 

일단 그전에 생어 시퀀싱을 하는 이유에 대해서 이야기 해보자면 NGS, Genotype array 분석에서 분석자들이 찾은 변이가 그 위치에 실제 있는지 확인차 하는 것입니다.

 

프라이머를 제작하기 위해서는 필요한 것이 당연히 확인 해야할(하고싶은) 시퀀스죠!

 

 확인해야할 시퀀스는 너무 길어도 안되고 너무 짧아도 안됩니다. (어쩌라고 라는생각이 들죠?)

 

 적당한 길이는 전체 100bp~200bp정도가 적당합니다. 그리고 확인해야할 위치와 프라이머가 적절한 거리가 있는 것이 좋습니다.

 

1. 원하는 위치의 시퀀스 확인하기

 

 저는 UCSC Genome browser(genome.ucsc.edu/)를 이용합니다.  ( 확인할 것은 Genome version!!)

 

Genome Browser에 들어갑니다.
View  -> DNA로 들어가서

예시로는 rs12951053로 해보겠습니다.

 

rs12951053로는 chr17:7674089 에 위치 하고있으니.

 

참고로 position에는 보고 싶은 위치가 1개라도 chr():pos-pos 이런식으로 다 써줘야합니다.

 

position다 써주셧으면, 위 아래로 얼만큼 볼건지 숫자를 쓰시고, get DNA를 누르시면됩니다. (저는 위아래 100 bp로)

 

get DNA를 누른후 결과 파일

 

 

그리고 이 결과를 이용하여 프라이머를 제작 할건데, 방법은 두가지가 있습니다.

 

1. NCBI의 Primer Blast ( www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)

2. IDT에서 제공해주는 primer tool (회원가입해야하는 귀찮음, sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index)

 

두가지에서 분석하면 결과가 다르게 나올 수 있습니다.

 

1. Primer Blast

 

 

grphical view 에서는 전체 시퀀스를 보여줍니다. 그런데 프라이머로 나온 시퀀스들은 왠지 원하는 위치를 시퀀싱을 해주지 않게 생겼습니다. 그래서 패스! 전체 중 가운데가 우리가 원하는 위치이기 때문에 포함되는 프라이머들을 찾아야 합니다.

 

 

2. IDT

 

 

 

결과에 보면 딱 하나가 나왔네요. 클릭 해서 들어가면 프라이머 시퀀스가 나옵니다.

 

 

 

이렇게 나온 프라이머를 이용해서 잘 만들어졌는지 확인을 해야합니다.

 

 

다시 UCSC Genome browser에 들어가서!

 

In-Silico PCR을 들어갑니다.

 

 

IDT에서 만든 forward, reverse를 넣고 submit!

 

 

 

다음과 같이 1개의 위치만 나오면 성공! 이때 위치가 두가지 이상으로 나올경우 프라이머를 다시 디자인 해야합니다.

 

 

실험하시는 분들에게 드릴때는 아래 온도 설정도 같이 주시고, 위치도 같이 주시면 됩니다!

 


여기까지 프라이머 제작에 대해서 알아보았습니다.  나름 급하게 만드느라 품질을 생각 못했는데,,

 

나중에 다시 읽어보면서 고칠부분 수정하도록 하겠습니다. (핵심적인 내용은 맞습니다! 제작하는방법이요!)

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